En un estudio reciente publicado en Micromáquinaslos investigadores evaluaron la eficacia de un sistema de decodificación genética para diagnosticar el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).
Fondo
El NSCLC es una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo. Apuntar a la sensibilización inducida por la mutación genética del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) con un inhibidor de la tirosina quinasa ha demostrado ser un tratamiento eficaz para el NSCLC. Por lo tanto, la estrategia terapéutica personalizada ha enfatizado la necesidad de tecnologías simples, rápidas e inteligentes para la decodificación genética de EGFR para facilitar la popularidad de la medicina de precisión.
Sobre el estudio
En el presente estudio, los investigadores combinaron la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) y el sistema de mutación refractaria de amplificación (ARMS) para producir OnePot-LAMP, un método simple, rápido y económico para la decodificación inteligente de EGFR.
El equipo desarrolló dos conjuntos de cebadores destinados a la decodificación de EGFR L858R para producir One-Pot-LAMP. Las variantes mutantes y de tipo salvaje se abrevian “M” y “WT” respectivamente, para simplificar este estudio. El conjunto de cebadores M consta de dos cebadores internos M y dos cebadores externos para identificar la variante mutante. El conjunto de cebadores WT consta de dos cebadores internos y dos externos para identificar la variante de tipo salvaje. Además, se crearon dos cebadores para la síntesis de plásmidos y la secuenciación del ácido desoxirribonucleico (ADN).
Se produjeron dos plásmidos que albergaban las secuencias de EGFR de la mutación WT o L858R. Los plásmidos recombinantes recuperados luego se convirtieron en Escherichia coli Células DH5ɑ antes de la extracción. Todos los plásmidos se validaron mediante secuenciación de ADN y se calcularon sus cantidades. El equipo obtuvo dos líneas celulares de cáncer de pulmón que portaban la mutación puntual L858R (NCI-H1975) y la variante WT (A549) de EGFR como muestras positivas y negativas, respectivamente.
Un total de 40 personas diagnosticadas con NSCLC se sometieron a resección de tejido maligno. Para el estudio posterior, todos los tejidos malignos se fijaron con formalina y se incluyeron en parafina. El ADN genómico se aisló de las líneas celulares y se extrajo el tejido maligno. Cuando la decodificación de EGFR L858R utiliza este enfoque, se realizan simultáneamente dos procesos de amplificación paralelos para cada muestra mediante la identificación de las variantes M y WT.
Resultados
Para decodificar la mutación EGFR L858R, se diseñaron dos cebadores internos para reconocer la variante objetivo en función de sus secuencias de ADN. El nucleótido de la mutación puntual L858R se colocó entre las regiones B1c y F1, con las dos regiones superpuestas en esta mutación. Por lo tanto, el nucleótido crítico del conjunto de cebadores asociado con la decodificación de EGFR L858R se construyó en el extremo 50 ubicado en el cebador interno.
Se usaron dos ensayos LAMP simultáneos para determinar el estado mutante de la mutación L858R en el EGFR. En particular, se generaron estructuras de bucle de doble tallo mediante el desplazamiento de hebras en las mezclas de reacción y funcionaron como catalizadores para la síntesis de ADN autocebante. El equipo notó que una estructura de bucle de doble tallo que consiste en nucleobases complementarias a la variante objetivo emergería en el tubo de variante de cebador emparejado. A su vez, conduce a la amplificación exponencial del ADN junto con la acumulación de ADN de bucle de tallo con longitudes de tallo variables.
En el tubo de variante de cebador no coincidente, emergería una estructura de doble bucle de tallo que comprende una nucleobase no complementaria, lo que evitaría la síntesis de ADN autocebante. Por lo tanto, la curva cinética de amplificación en forma de S obtenida de la amplificación exponencial del ADN solo sería visible si la muestra tuviera la variante coincidente con el conjunto de cebadores.
La variante M dio como resultado una gran amplificación de la señal en el tubo M, mientras que la variante WT dio como resultado una amplificación exclusivamente en el tubo WT. En relación con el par de variantes de cebadores no coincidentes, el equipo observó que los pares de variantes de cebadores coincidentes generaban una gran curva cinética de amplificación en forma de S, lo que facilitaba la determinación del estado de mutación del EGFR. Teniendo en cuenta el control negativo, las curvas cinéticas de amplificación para los tubos M y WT fueron consistentes con las observadas para el par de variante de cebador no coincidente.
El rendimiento de One-Pot-LAMP se evaluó en condiciones ideales y se usaron plásmidos como estándar de control de secuencia. La mezcla total de plásmidos se usó en la mezcla de reacción para evaluar la capacidad del método para identificar la variante diana en presencia de un fondo interferencial.
Incluso cuando la concentración del plásmido objetivo era de aproximadamente 0,1 %, se encontraron curvas cinéticas de amplificación en forma de S notables para todas las muestras de prueba que contenían la variante objetivo en 40 minutos. Sin embargo, no hubo señal de amplificación para la mezcla de plásmidos que no contenía variante objetivo, lo que demuestra la excelente sensibilidad y especificidad de este enfoque.
Conclusión
Los hallazgos del estudio mostraron que One-Pot-LAMP proporcionó una gran sensibilidad y especificidad al mismo tiempo que se adaptó fácilmente para la decodificación de información genética adicional mediante el rediseño de los conjuntos de cebadores. Utilizando datos del mundo real, se validó el rendimiento de One-Pot-LAMP para detectar la mutación EGFR L858R, lo que indica la gran promesa de este método sin complicaciones para el diagnóstico de NSCLC en la práctica clínica.
