Un estudio reciente publicado en Nutrientes desarrolló un ensayo novedoso y de alto rendimiento para evaluar el péptido antimicrobiano de catelicidina (CAMP).
Fondo
Las catelicidinas exhiben una actividad de amplio espectro contra bacterias grampositivas y negativas, patógenos virales y hongos. Las células inmunitarias innatas, como las células dendríticas, los monocitos, los neutrófilos y los macrófagos, expresan el gen CAMP humano.
La vitamina D es crucial para la expresión de CAMP, y los niveles deficientes se han asociado con tasas más altas de neumonía, influenza, vaginosis bacteriana, tuberculosis e infección del tracto respiratorio superior.
Sobre el estudio
En el presente estudio, los investigadores desarrollaron un nuevo ensayo CAMP de alto rendimiento (HiTCA).
Repeticiones palindrómicas agrupadas regularmente intercaladas (CRISPR)/proteína asociada a CRISPR 9 (Cas9) mediada por knock-in del reportero del gen fluorescente mCherry se realizó en el extremo 3′ del ACAMPAR gen en la línea celular SC de monocitos-macrófagos. Se generaron ribonucleoproteínas con Cas9 y un ARN guía único modificado (sgRNA) dirigido al extremo 3′ del gen CAMP.
Además, también se sintetizaron plásmidos donantes con mCherry flanqueados por brazos homólogos del objetivo. Los plásmidos donantes y los complejos Cas9-sgRNA se sometieron a electroporación en células SC. El ADN genómico fue aislado, amplificado y secuenciado. Los grupos de células se sembraron usando una impresora de una sola célula para generar poblaciones de células monoclonales.
Los investigadores identificaron una población monoclonal de células SC humanas CAMPmCherry homocigóticas (células HiTCA). HiTCA y células SC de tipo salvaje (WT) se cultivaron en medios para el mantenimiento y se analizaron periódicamente para determinar su viabilidad. Las células HiTCA se incubaron con suero humano y metabolitos de tratamiento, como metabolitos de vitamina D o etanol. Se incubaron durante 24 horas y se realizó un análisis de citometría de flujo de alto rendimiento. Las células WT sirvieron como controles negativos.
El equipo probó la capacidad de respuesta de las células HiTCA a la 25-hidroxivitamina D3 (25(OH)D3) a través de su catálisis a la 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3) por el miembro 1 de la subfamilia B de la familia 27 del citocromo P450 (CYP27B1). )-hidroxilasa. El efecto del suero humano sobre la respuesta de CAMP se evaluó mediante la coincubación de células HiTCA con sueros humanos agrupados. Además, el ensayo de alto rendimiento se probó en un experimento piloto utilizando sueros de cinco hombres blancos y cinco negros.
Recomendaciones
Los investigadores observaron una respuesta dependiente de la dosis de las células HiTCA a la 25(OH)D3. Las células tratadas con etanol y 25(OH)D3 1 nM mostraron una expresión inicial (CAMPmCherry al 10 %). Esto aumentó al 50 % y al 100 % con 25(OH)D3 10 nM y 100 nM, respectivamente, comparable a los niveles observados en las células tratadas con 1,25(OH)2D3. Esto sugiere que las células HiTCA podrían convertir la 25(OH)D3 inactiva en la 1,25(OH)2D3 activa.
La incubación de células HiTCA con sueros humanos provocó la atenuación de la expresión de CAMPmCherry de forma dependiente de la dosis. La respuesta a los sueros fue constante en todas las condiciones de tratamiento con metabolitos. En el experimento piloto con sueros de donantes humanos, el equipo usó concentraciones séricas de 0,3 % y 10 % para examinar si la diferencia ACAMPAR se produjo la expresión.
Asimismo, la expresión de HiTCA CAMPmCherry se atenuó a una concentración de suero de donante del 10 % en comparación con el 0,3 %. En particular, a la concentración más baja (0,3 %), la respuesta de CAMPmCherry fue de cinco a siete veces mayor con 1,25 (OH) 2D3 10 nM y 25 (OH) D3 100 nm. La respuesta de CAMPmCherry en los sueros de los hombres negros fue mayor que la de los hombres blancos, aunque los niveles séricos de 1,25(OH)2D3 y 25(OH)D3 fueron más bajos en las muestras negras.
Conclusiones
En resumen, los investigadores desarrollaron HiTCA que aborda las limitaciones asociadas con un anterior ex-vivo Ensayo CAMP en un flujo de trabajo de alto rendimiento totalmente escalable. La respuesta de CAMPmCherry fue fuertemente inducida por 25(OH)D3 exógena o 1,25(OH)2D3 sin suero. No obstante, cuando se añadió suero, la respuesta de CAMPmCherry se atenuó fuertemente. El refinamiento y las pruebas adicionales de este ensayo pueden resultar valiosos para identificar los factores séricos que influyen en la función inmunorreguladora de la vitamina D.
