Las cadenas polipeptídicas nacientes o polipeptidil-tRNA (pep-tRNA) se producen de forma transitoria durante la síntesis de proteínas. El potencial para estudiar estos intermediarios y comprender mejor su papel en procesos como la regulación de genes se ha mejorado enormemente con el desarrollo de un proceso denominado PETEOS, abreviatura de enriquecimiento de peptidil-tRNA mediante extracción orgánica y adsorción de sílice. Este método, desarrollado por científicos de Tokyo Tech, permite la recolección, el procesamiento y la identificación a gran escala de fracciones de polipéptido pep-tRNA.
Crédito de la imagen: Instituto de Tecnología de Tokio
Los avances en biología molecular han revelado que los pep-tRNA, polipéptidos nacientes dentro del ribosoma que se unen covalentemente al ARN de transferencia, están involucrados en una gran variedad de funciones celulares, incluida la expresión génica. Todas las proteínas existen como pep-tRNA en algún momento y estudiar estos intermediarios de traducción es vital, ya que poseen propiedades tanto de ARN como de proteína y pueden ayudar a los investigadores a comprender mejor los detalles de la traducción. Dependiendo de los estímulos y/o tensiones, la regulación de la traducción es muy rápida y abarca la iniciación, la elongación y la pausa de la elongación. Por lo tanto, obtener información más profunda sobre el proceso de traducción requiere un método adecuado para procesar pep-tRNA en grandes cantidades. Estos matices han impulsado el desarrollo de herramientas moleculares para investigar la traducción celular.
En la actualidad, los dos enfoques principales que se utilizan para estudiar la traducción celular aprovechan estrategias muy diferentes. El primero, el perfilado de ribosomas, una poderosa tecnología de secuenciación profunda, monitorea la traducción apuntando a fragmentos de ARNm protegidos por ribosomas producidos a partir de la digestión con RNasa. Desafortunadamente, este enfoque es intrínsecamente incapaz de capturar pep-tRNA, requiere mucho tiempo, es costoso y requiere muchos datos. La alternativa se basa en la proteómica con cromatografía líquida-espectroscopia de masas en tándem (LC-MS/MS) y requiere el uso de aminoácidos inusuales para marcar polipéptidos. Sin embargo, tales enfoques proteómicos requieren mucho tiempo y, lo que es más importante, no capturan el estado de elongación de la traducción de la célula, ya que los pep-tRNA no están dirigidos directamente.
Para sortear estas limitaciones en la tecnología ‘pep-tRNA-ome’, un equipo de científicos del Instituto de Tecnología de Tokio (Tokyo Tech), dirigido por el profesor Hideki Taguchi, desarrolló PETEOS. Sus hallazgos han sido publicados ahora en Investigación de ácidos nucleicos. Con respecto a las principales ventajas de su trabajo, el profesor Taguchi explica: “Esta metodología sin etiquetado es única porque enriquece específicamente y captura rápidamente los pep-tRNA al mismo tiempo que complementa las plataformas de análisis de traducción convencionales”.
PETEOS tiene cuatro pasos. Primero, el ARN se enriquece mediante extracción con disolventes orgánicos y luego se aísla en una columna de sílice. A continuación, los polipéptidos diana en los pep-tRNA aislados se separan de sus ribonucleótidos utilizando una combinación de pH y temperatura elevados. Luego, los polipéptidos liberados se someten a digestión enzimática y se escinden. Y, por último, estos polipéptidos se identifican utilizando proteómica de escopeta LC-MS/MS. “Como prueba de concepto, pudimos identificar casi 800 E. coli proteínas que se derivaron de pep-tRNA usando PETEOS. Es importante destacar que estas proteínas estaban enriquecidas en N-terminales, lo que subraya que el método realmente captura el grupo intermedio de pep-tRNA durante la traducción. “, dice el profesor Taguchi cuando se le preguntó sobre la importancia de su nuevo método.
El equipo también pudo demostrar que PETEOS podía capturar “capturas de pantalla” del nascentoma, el grupo de pep-tRNA nacientes presentes en un momento dado, cuando E. coli las células se sometieron a tratamientos de choque térmico y antibióticos. PETEOS superó a los métodos convencionales en cuanto a la capacidad de capturar la expresión aguda de proteínas bajo estrés por calor y la reorganización del nascentoma tras la exposición a diferentes antibióticos.
PETEOS tiene algunas limitaciones, incluida la dificultad para analizar pep-tRNA de baja abundancia mediante LC-MS/MS, capacidad cuantitativa limitada debido al paso ácido de fenol/cloroformo, sin resolución a nivel de codón y dificultad para capturar el extremo C-terminal del polipéptido en crecimiento. Sin embargo, algunos de estos problemas también existen para los enfoques convencionales y pueden superarse mejorando la eficiencia de enriquecimiento del péptido C-terminal de este proceso.
El equipo cree que existe un enorme potencial para optimizar su protocolo en el futuro.
A pesar de las limitaciones, confiamos en que PETEOS tiene potencial, ya que permite realizar análisis que los métodos de traducción actuales simplemente no pueden. ¡Lo más importante es que se puede aplicar a cualquier organismo! “
Prof. Hideki Taguchi, Tecnología de Tokio
Con más investigación en este campo, profundizaremos nuestra comprensión de la síntesis de proteínas.
Fuente:
Referencia de la revista:
Yamakawa, A., et al. (2023) Un método para enriquecer polipeptidil-tRNA para capturar instantáneas de traducción en la célula. Investigación de ácidos nucleicos. doi.org/10.1093/nar/gkac1276.
