La respuesta del murciélago de la fruta de Jamaica al SARS-CoV-2 adaptada a humanos

En un estudio reciente publicado en el bioRxiv* servidor, los investigadores examinaron la vulnerabilidad de los murciélagos de la fruta de Jamaica (Artibeus jamaicensis) al síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Buscaron evidencia de cómo los murciélagos usan su inmunidad innata y adaptativa para atacar al SARS-CoV-2 u otros coronavirus (CoVs), aunque no presentan síntomas clínicos aparentes.

Estudiar: Respuesta similar a la de las células T reguladoras al SARS-CoV-2 en murciélagos frugívoros de Jamaica transducidos con ACE2 humana. Haber de imagen: Melinda Fawver/Shutterstock

Fondo

Los CoV naturales (o salvajes) infectan a varias especies de murciélagos, pero han permanecido confinados en sus intestinos, lo que indica transmisión viral fecal-oral; sin embargo, los estudios apenas han revelado la biología de los CoV relacionados con el SARS en murciélagos. Con toda probabilidad, rinolofo Las especies de murciélagos albergaron el SARS-CoV-2 ancestral que primero se derramó en los huéspedes zoonóticos del puente y evolucionó aún más para transmitirse entre los humanos dando lugar a la pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19).

Es poco probable que el SARS-CoV ancestral se descubra alguna vez porque se ha extinguido, mutado o recombinado con otros sarbecovirus. Esto también sugiere que los aislamientos iniciales de Wuhan del SARS-CoV-2 podrían comportarse de manera diferente en los murciélagos frugívoros de Jamaica.

Sobre el estudio

En el presente estudio, los investigadores inocularon un adenovirus defectuoso en la replicación (Adv) que codifica la enzima convertidora de angiotensina humana 2 (hACE2) o Adv/hACE2 en murciélagos frugívoros de Jamaica por vía intranasal. Luego los desafiaron con SARS-CoV-2 después de cinco días.

Los investigadores utilizaron una colonia de reproducción de esta especie de murciélago que habían establecido en 2006 para realizar estudios de infección con varios virus, incluidos el SARS y el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS)-CoV. Inicialmente, mantuvieron esta colonia de murciélagos en una instalación de vuelo libre. Sin embargo, cambiaron los murciélagos infectados con virus a jaulas bajo el nivel de bioseguridad 3 (BSL-3) después de la exposición al aislado SARS-CoV-2 WA1. Obtuvieron esta cepa del depósito de recursos de investigación de Biodefensa e Infecciones Emergentes (BEI) y la pasaron en células Vero E6 para generar un stock.

A continuación, el equipo inoculó a los murciélagos por vía intranasal con 10⁵ mediana de dosis infecciosas de cultivo de tejidos (TC_ID50) del virus. Mantuvieron a los murciélagos en una posición contralateral para asegurar la entrega a los pulmones y el tracto gastrointestinal. Posteriormente, recogieron hisopos orales y rectales en los días dos, cuatro, siete, 10, 14 y 21 posteriores a la inoculación (PI) para la detección de ácido ribonucleico viral (ARN) mediante reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR).

Eventualmente, sacrificaron murciélagos para una necropsia y recolectaron y congelaron porciones de sus pulmones e intestinos para la extracción de ARN y el aislamiento del virus. Utilizaron un kit de detección de genes de envoltura (E) SARS-CoV-2 para qPCR de ARN extraído de tejidos de murciélago congelados.

Para in vitro En los estudios, los investigadores utilizaron coxsackievirus y receptor de adenovirus (CAR) para transducir células epiteliales renales primarias (Ajk) de murciélago frugívoro de Jamaica con un serotipo Ad5 defectuoso en la replicación con una proteína fluorescente verde (GFP), a la multiplicidad de infección (MOI) igual a uno por una hora. Dado que CAR comparte un 86 % y un 92 % de identidad y similitud con su homólogo de ratón, respectivamente, era ideal para estos experimentos. El equipo monitoreó la fluorescencia sostenida durante varios días. Posteriormente, inocularon estas células con el virus sin GFP para el desafío del SARS-CoV-2. Para en vivo experimentos, inocularon cinco murciélagos transducidos con hACE2 por vía intranasal usando 2.5×10⁸ unidades formadoras de placa (PFU) del aislado SARS-CoV-2 WA1 en 50 µl de medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM).

Doce días después, sacrificaron a estos animales para recolectar bazos para el marcador inducido por activación (AIM) prueba. Esta prueba utiliza un biomarcador CD154 que identifica células T auxiliares raras (Th) reactivas al antígeno (menos del 2 % de semanas después de la infección) mediante citometría de flujo (FC). La rareza de estas células hace que la evaluación de ex-vivo Respuestas de células T desafiantes. Además, el equipo también determinó que un grupo de diferenciación 4 (CD4)⁺ Las células Th respondieron a la infección por SARS-CoV-2 en los murciélagos transducidos con hACE2.

Hallazgos del estudio

Los residuos de ACE2 conservados difieren notablemente entre las especies de murciélagos de herradura. Por ejemplo, los murciélagos frugívoros de Jamaica han conservado 13 de 20 residuos de ACE2 (moderados). Debido a los bajos niveles endógenos de ARN mensajero de ACE2 en los pulmones de los murciélagos, los investigadores no pudieron detectar el SARS-CoV-2 en sus pulmones. Aunque el virus se replicó en los murciélagos, lo hizo solo durante unos días, y los murciélagos no mostraron síntomas clínicos aparentes de enfermedad o pérdida de peso.

El SARS-CoV-2 WA1 permaneció confinado en el intestino de los murciélagos, principalmente en las placas de Peyer y en las células mononucleares de la lámina propia intestinal. Además, no notaron aparente diseminación viral en heces de murciélago, y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) sensible a la proteína de la nucleocápside (NC) del SARS-CoV-2 tampoco pudo detectar la respuesta de anticuerpos anti-SARS-CoV-2. En general, estos resultados sugirieron que el SARS-CoV-2 tenía poca susceptibilidad para unirse a ACE2 del murciélago de la fruta de Jamaica (AjACE2), lo que hace que las células del murciélago de la fruta de Jamaica sean poco permisibles para el virus.

Quizás, las células Ajk carecían de la serina proteasa 2 transmembrana (TMPRSS2) que facilita la entrada del SARS-CoV-2 a través de la membrana plasmática. También es posible que la transducción de Adv activara vías antivirales en estas células que delimitaban la replicación del SARS-CoV-2. Otra posibilidad es que las células infectadas con SARS-CoV-2 a través de catepsina L facilitan la evasión endosómica del ARN genómico (ARNg). No obstante, la transducción de hACE2 resultó en una infección ineficiente por SARS-CoV-2 en otras líneas celulares de murciélago, ninguna de origen renal. Una de las líneas celulares produjo viriones infecciosos; sin embargo, esos virus no pudieron completar la exocitosis, probablemente debido a la tetherina, como se observó mediante microscopía electrónica.

En murciélagos transducidos con hACE2 desafiados con SARS-CoV-2 WA1, los investigadores detectaron niveles bajos de ARN viral al principio de la infección, probablemente debido a la penetrancia limitada de Ad5/hACE2 en los extremos distales de los animales de prueba de donde los investigadores extrajeron el ARN. Los resultados histológicos también mostraron una patología clara en los pulmones de murciélago infectados transducidos con hACE, y los investigadores detectaron fácilmente antígenos en sus bronquios principales. En murciélagos desafiados con SARS-CoV-2, las respuestas de anticuerpos de bajo título comenzaron el día 4. El título de las respuestas de anticuerpos se mantuvo bajo, incluso 21 días PI, probablemente debido a la falta de expresión de IL-21. Aunque también es posible que los murciélagos tengan respuestas inmunitarias innatas robustas que sean menos dependientes de las respuestas de anticuerpos.

Los autores observaron que los cultivos de esplenocitos de tres de los cuatro murciélagos estimulados durante 24 horas con el antígeno de la biblioteca de péptidos NC no mostraron aumentos repentinos en las transcripciones de interferón-γ (IFNγ) o interleucina-21 (IL-21). Además, hubo un marcado aumento en la expresión de CD154 en CD4⁺ Células Th (asociadas con COVID-19 grave). Del mismo modo, la IL-10 y el factor de necrosis tumoral beta (TGFβ) aumentaron más del doble, a pesar de <2 % de células Th específicas de SARS-CoV-2 S en los cultivos celulares.

Por último, algunos subconjuntos de células T reguladoras (Treg) utilizan estas citocinas para suprimir las respuestas inflamatorias. Los autores notaron un aumento en las transcripciones de ARNm de los marcadores de células Th CD4 y Cxcr4, lo que sugiere que su actividad podría ser menor en los murciélagos o desempeñar un papel diferente en comparación con los humanos. Por lo tanto, hubo diferencias en el comportamiento de las células Th en murciélagos y humanos infectados con SARS-CoV-2.

Conclusiones

Con los avances en los métodos y reactivos para estudiar la inmunidad adaptativa de los murciélagos, habrá más claridad con respecto a las funciones que desempeñan las células T de los murciélagos en la inmunidad a los virus. Los estudios adicionales también deberían centrarse en examinar el papel de las células T individuales en los murciélagos utilizando nuevas técnicas, como FC, cultivo de células T o secuenciación de ARN de resolución de una sola célula. En este contexto, como lo demuestra el estudio actual, los vectores Adv del serotipo 5 podrían resultar beneficiosos. Podrían ayudar a diseccionar las infecciones virales de los murciélagos, incluidas las variantes del SARS-CoV-2, y cómo responde su sistema inmunitario adaptativo a estos virus.

*Noticia importante

bioRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica/el comportamiento relacionado con la salud ni tratarse como información establecida.