En un estudio reciente publicado en Celúlalos investigadores informaron de la circulación de un nuevo coronavirus (CoV) similar al síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) entre los pangolines malayos, Manis javanica CoV asociado a HKU4 (MjHKU4r-CoV).
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El origen zoonótico y la transmisión de CoV que causan brotes en humanos, como MERS, síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), no está bien caracterizado. Los murciélagos albergan varios coronavirus desde el Merbecovirus y Subgénero Sarbecovirus, y MERS-CoV, SARS-CoV-1 y -2 supuestamente se originaron en murciélagos.
Sin embargo, los CoV de murciélago generalmente necesitan más adaptaciones antes de infectar y replicarse en las células huésped, lo que indica la necesidad de huéspedes animales intermedios. Se requieren esfuerzos continuos de vigilancia e investigación para profundizar la comprensión de los pangolines como huéspedes susceptibles o reservorios de CoV asociados a murciélagos y mejorar la preparación para la probable aparición de CoV similares a MERS en pangolines.
Sobre el estudio
En el presente estudio, los investigadores exploraron los pangolines como reservorios o especies huésped susceptibles para la transmisión del CoV por murciélagos zoonóticos.
Las muestras de hisopos de la región anal (n = 86) de pangolines malayos, contrabandeados ilegalmente desde las regiones del sudeste de Asia a China, se sometieron a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa y en tiempo real de pan-CoV con el ácido ribonucleico (ARN) dependiente. El gen de la ARN polimerasa (RdRp) como diana.
Posteriormente, secuenciación de próxima generación, análisis de metagenómica, secuenciación de Sanger, amplificación rápida de extremos de ácido desoxirribonucleico complementario (RACE), análisis filogenéticoSe realizaron análisis , Western blot y recombinantes. Se realizaron experimentos de interferometría de biocapa, producción de interferón-I (IFN-I) y ensayos de indicador de luciferasa de señalización, ensayos antivirales y ensayos de neutralización viral de reducción de fluorescencia.
Para investigar la prevalencia de MjHKU4r-CoV entre los pangolines, se realizaron ensayos del sistema de inmunoprecipitación de luciferasa (LIPS) basados en la proteína de la nucleocápside (NP) de MjHKU4-CoV-1. Además, las partículas virales se examinaron mediante microscopía electrónica de transmisión y se realizó un análisis de inmunofluorescencia utilizando células de adenocarcinoma colorrectal humano (células Caco-2) para la tinción de NP.
El equipo investigó si MjHKU4r-CoV-1 usaba la dipeptidil peptidasa-4 humana (hDPP4) para la entrada celular mediante la inoculación de líneas celulares de hepatoma humano (Huh-7) con y sin DPP4 con MjHKU4r-CoV-1. El equipo evaluó si las mutaciones puntuales en la región estimada de escisión de furina reducirían la escisión de la proteína de pico proteolítico (S) y la infección viral.
Además, el equipo investigó si la escisión de la proteasa era específica de la furina y si MjHKU4r-CoV-1 podía infectar a murciélagos y humanos. Se determinó el probable rango de huéspedes del virus. La infección por MjHKU4r-CoV-1 se evaluó en varias líneas celulares, órganos y ex-vivo organoides. Además, en vivo los análisis se realizaron utilizando ratones transgénicos hDPP4 desafiados por vía intranasal con MjHKU4r-CoV-1 para evaluar la patogenicidad de MjHKU4r-CoV-1. Se determinaron los antagonistas de interferón codificados viralmente y la eficacia terapéutica de los agentes de tratamiento conocidos contra MjHKU4r-CoV-1.
Resultados
Se identificó entre los pangolines malayos un nuevo coronavirus similar al MERS (Merbecovirus) MjHKU4r-CoV, asociado filogenéticamente con HKU4-CoV de murciélago. Las células Caco-2 del virus MjHKU4r-CoV-1 aisladas utilizaron hDPP4 y proteasas celulares para la entrada celular, y la unión se mejoró mediante un sitio de escisión de furina (muy probablemente RQQR) ausente en los HKU4r-CoV de murciélago conocidos. MjHKU4r-CoV-1 tenía una gama de huéspedes más amplia, ampliada por furina, en comparación con HKU4-CoV de murciélagos, y era infeccioso y patógeno entre los animales murinos transgénicos y los organoides intestinales y respiratorios de los humanos.
De 86 animales, cuatro fueron seropositivos por pan-CoV PCR y siete muestras de suero mostraron seropositividad para MjHKU4r-CoV en los ensayos LIPS (11 % y 13 %). Se obtuvieron cuatro secuencias genómicas casi idénticas a partir de muestras de Manis javanica CoV 1 a 4 asociado a HKU4 (MjHKU4r-CoV-1–4). MjHKU4r-CoV-1 compartió una identidad genética del 87 % y el 68 % con HKU4-CoV y MERS-CoV, respectivamente. MjHKU4r-CoV-1 mostró la mayor similitud de nucleótidos con HKU4-CoV de murciélagos.
No se observaron eventos de recombinación en las secuencias genómicas de MjHKU4r-CoV-1. Se descubrió que MjHKU4r-CoV-1 pertenecía a la Murciélago Tylonycteris CoV HKU4 especies de Merbecovirus subgénero Las partículas virales mostraron la morfología habitual de CoV y un diámetro de 100,0 nm. La infección por MjHKU4r-CoV-1 se redujo considerablemente en las células de hepatoma humano pretratadas con E64D, un inhibidor de la proteasa de clase cisteína. La enzima tripsina no fue necesaria para la infección viral, lo que indica que MjHKU4r-CoV-1 se adaptó completamente a la escisión de tipo proteolítico entre las células humanas.
El equipo observó la escisión proteolítica de MERS-CoV y MjHKU4r-CoV-1 de tipo salvaje. proteínas de espiga pero no para las proteínas mutadas de HKU4-CoV y MjHKU4r-CoV-1. Una proteasa huésped escindió la proteína de pico MjHKU4r-CoV-1 durante la síntesis, y la escisión fue fundamental para la entrada celular. La infección con MjHKU4r-CoV-1 estuvo mediada por ortólogos de la proteína DPP4 de cabras, cerdos, conejos, gatos, ovejas, macacos, camellos, vacas y titíes, pero no de caballos, hurones, hámsteres, ratas, ratones y perros. MjHKU4r-CoV-1 proliferó efectivamente en células humanas A549, Caco-2, Calu-3, Huh-7 y riñón embrionario humano 293 (HEK293), lo que indica un amplio tropismo viral.
La infección por MjHKU4r-CoV-1 provocó respuestas retardadas de interferón en las líneas celulares Caco-2, lo que indica que el virus evadió la respuesta del interferón (IFN) del huésped. Spike, membrana (M), marco de lectura abierto (ORF)-3 y 04a inhibieron significativamente la activación del promotor IFN-β, mientras que M, NP, ORF-3, -4a y -4b y -8b inhibieron significativamente la actividad promotora del elemento de respuesta estimulado por interferón tipo I (ISRE). Remdesivir, EIDD-2801 y C376 mostraron efectos anti-MjHKU4r-CoV-1, suprimiendo la infección por MERS-CoV y MjHKU4r-CoV-1 en un grado similar.
Conclusión
En general, los hallazgos del estudio destacaron un nuevo CoV circulante similar al MERS entre los animales de pangolín malayo y mostraron que los pangolines son reservorios de coronavirus que probablemente afecten a los humanos.
