Caracterizando con precisión el microambiente tumoral cuando el acceso a la muestra de tejido es restringido puede ser un llave desafío en la inmuno-oncología campo. El equilibrio y la infiltración tumoral de T–las subpoblaciones celulares son de significativo interés. En esta entrevista, NewsMedical habla con Cerba Investigación sobre el uso y el valor de la inmunoquímica reguladora de T múltiplex para la validación analítica de tumores sólidos.
¿Qué son las células T y por qué son importantes?
Las células T generalmente se clasifican como células auxiliares (Th), citotóxicas (Tcyto), de memoria o reguladoras (Treg). Las células T se consideran células efectoras inmunitarias importantes, lo que las convierte en objetivos preferidos para la inmunomodulación. Las células Tcito brindan respuestas inmunitarias óptimas y protegen contra los microbios y tumores invasores antígenos. En condiciones homeostáticas, las Treg fomentan la tolerancia periférica. Sin embargo, en lo que respecta a los tumores, las Treg pueden suprimir las funciones de las células Tcito.
¿Qué es el protocolo multiplex y cómo se desarrolló?
Cerba Research desarrolló el protocolo multiplex, Histoperfil®– Panel de luz T-reg, usando la plataforma Discovery ULTRA (Ventana), que fue diseñada para teñir subpoblaciones de células T específicas en un solo portaobjetos. Esto evitó la necesidad de secciones en serie de muestras valiosas fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE) de un paciente en ensayos clínicos, al mismo tiempo que ofrece un análisis integral del microambiente tumoral.
El protocolo multiplex se optimizó y validó previamente en una muestra FFPE de cáncer de pulmón de células no pequeñas. La validación analítica incluyó pruebas de especificidad, sensibilidad, precisión y estabilidad antigénica en amígdalas sanas (control) y muestras patológicas de FFPE de mama, pulmón, cabeza y cuello y colon obtenidas del biobanco Cerba Research Montpellier.
¿Puede describir una aplicación específica que involucre el Histoprofile?®– ¿Protocolo múltiplex del panel de luz T-reg?
Para evaluar Histoprofile®-Especificidad del protocolo de luz T-reg, el protocolo multiplex se utilizó para investigar muestras de amígdalas humanas sanas (controles negativos/positivos). Una TMA sana de múltiples tejidos aprobada por la FDA comprendía 33 tejidos diferentes de tres donantes. En esta aplicación, un patólogo validó la especificidad de los tres biomarcadores en todos los tejidos analizados.
El Histoperfil®-El protocolo de luz Tregs se probó en una variedad de muestras FFPE de tumores sólidos, incluido el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), el cáncer de mama triple negativo (TNBC), el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) y el cáncer colorrectal (CRC). ).
Un TMA de cáncer multiorgánico complementó bloques de tejido para evaluar un número suficiente de muestras para cada indicación. Luego, un patólogo calificó los portaobjetos para brindar un análisis semicuantitativo de los objetivos y confirmar la especificidad.
¿Cómo es la precisión analítica del Histoprofile?®– ¿Panel de luz T-reg evaluado?
Evaluar la precisión analítica del Histoprofile®-Protocolo de luz T-reg, realizamos reproducibilidad intraejecución e interejecución en dos muestras de cáncer de mama, pulmón, colorrectal y de cabeza y cuello. En esta evaluación, los portaobjetos se analizaron con Halo para determinar la densidad celular. A continuación, se calculó el CV medio de todas las muestras para cada tipo de tejido y tumores sólidos.
Cuando se utilizan densidades de células positivas para CD3, CD8 y FoxP3 como lectura para el protocolo, es posible cumplir con los criterios de aceptación (CV<20 %) para tumores sólidos. Para CD3, el CV es del 21 %, pero en Cerba Research lo consideramos suficiente debido a una baja densidad de células positivas (<5 % del total de células).
¿Cómo se hace para probar la estabilidad del antígeno?
Para evaluar la estabilidad de los objetivos en el Histoprofile®-Protocolo de luz T-reg, es necesario un experimento de cinética para analizar la misma muestra envejecida durante un período de tiempo (desde fresca hasta tres meses). Esta prueba generalmente se realiza utilizando dos muestras por indicación, con diferentes rangos de expresión de la señal.
Con el tiempo, las imágenes resultantes de una muestra de NSCLC se evaluaron con el software de análisis de imágenes Halo. Los portaobjetos incluidos en la prueba de estabilidad se analizaron con el software Halo para establecer la densidad celular de cada objetivo del múltiplex.
¿Cuáles son los biomarcadores clave que indican un tratamiento eficaz?
La infiltración de células T en el tumor es un biomarcador clave para estimar la respuesta a las terapias inmunitarias de punto de control. En un estudio particular, se tiñeron cinco muestras de cáncer colorrectal (CCR) con el Histoprofile®-Panel de luz T-reg y luego se analizó con Halo para determinar las densidades de células T CD8 y células Treg en los compartimentos de tumor y estroma, y las densidades de las poblaciones celulares en el borde del tumor/estroma.
En este caso particular, hubo significativamente más Tregs en el estroma que en el tumor (p = 0,026). De manera similar, estaban presentes más células T en el compartimiento del estroma que en el tumor, pero no a un nivel significativo (p = 0,096). Se observó una acumulación de células T y células Tregs en el lado estromal de la interfase.
Qué hace el Histoprofile®– ¿El protocolo múltiplex del panel de luz T-reg es una herramienta destacada para el estudio de las poblaciones de células T?
Después de demostrar una clara especificidad y sensibilidad, el rendimiento analítico del Histoprofile®-El protocolo de luz T-reg que usa anti-CD8, anti-CD3 y anti-FoxP3 indicó la capacidad de detectar células Tcyto y Treg en una variedad de tumores sólidos, incluidos, entre otros, pulmón, cabeza y cuello, mama y cáncer colonrectal Tejidos FFPE. El protocolo cumplió con los criterios de aceptación en relación con la repetibilidad y la reproducibilidad entre ensayos.
La estabilidad del antígeno muestra que es posible detectar antígenos a un nivel similar a las secciones frescas después de tres meses. En Cerba Research, el Histoprofile®-El protocolo de luz T-reg se ha validado en tumores sólidos a un nivel de punto final experimental.
El análisis espacial del protocolo proporciona un análisis en profundidad del microambiente tumoral, lo que permite apreciar la infiltración de células inmunitarias en el tumor. Creemos que el Histoprofile®– El panel de luz T-reg es una herramienta práctica que facilita la investigación de poblaciones de células T en varios tumores sólidos humanos en ensayos clínicos.
Figura 1. Comparación de la densidad celular entre portaobjetos simplex y multiplex. Crédito de la imagen: Investigación de Cerba
Figura 2. Evaluación de especificidad en muestras FFPE de amígdalas sanas. Imágenes representativas de dos muestras de amígdalas teñidas con el Histoprofile®-Panel de luz Tregs. CD3 (Rojo), CD8 (Naranja) y FoxP3 (Verde). Barra de escala: 50 μm. Crédito de la imagen: Investigación de Cerba
Figura 3. Mapa de calor de los resultados de especificidad obtenidos en Healthy Tonsil Blocks y Healthy Multi-organ TMA. El recuento representa el número de muestras teñidas para cada tejido y cada objetivo en cada rango de porcentaje de células positivas. Crédito de la imagen: Investigación de Cerba
Figura 4. Mapa de Calor de los resultados de sensibilidad obtenidos en Bloques y TMA Multi-órgano. El recuento representa el número de muestras teñidas para cada tejido y cada objetivo en cada rango de porcentaje de células positivas. Crédito de la imagen: Investigación de Cerba
Figura 5. Imágenes representativas de la evaluación de precisión del Histoprofile®-Protocolo de luz T-reg en NSCLC, TNBC, HNSCC y CRC. CD3 (Rojo), CD8 (Naranja) y FoxP3 (Verde). Barra de escala = 100 μm. Crédito de la imagen: Investigación de Cerba
Figura 6. Gráfico de distribución de láminas de prueba de reproducibilidad. Densidades de células CD3 (fila superior), CD8 (fila central) y FoxP3 (fila inferior) en función de la muestra y las indicaciones. Crédito de la imagen: Investigación de Cerba
Figura 7. Evaluación de estabilidad de CD3/CD8/FoxP3 en NSCLC. De arriba a abajo: combinar, CD3 (rojo), CD8 (naranja), FoxP3 (verde). Barra de escala = 100 μm. Crédito de la imagen: Investigación de Cerba
Figura 8. Imágenes representativas del análisis espacial usando HaLo (la línea verde representa la interfaz Tumor/Sroma. Imagen izquierda: Histoprofile®-Panel de luces Tregs CD3 (rojo), CD8 (naranja), FoxP3 (verde). Imagen central: máscaras Halo para células T (arriba) y Tregs (abajo). Imagen derecha: Representación de halo de las áreas evaluadas durante el análisis de la interfaz. Cada color representa una distancia de 10 μm. Barra de escala = 100 μm. Crédito de la imagen: Investigación de Cerba
Figura 9. Diagrama de caja para la densidad de Tregs (arriba) y células T (abajo) en el estroma (azul) y el tumor (rojo) para cinco muestras de CRC. Crédito de la imagen: Investigación de Cerba
Figura 10. Gráfico de área que muestra la infiltración de Tregs (rojo) y células T (azul) en el tumor (izquierda) desde el estroma (derecha) para cinco muestras de CRC. Crédito de la imagen: Investigación de Cerba
Acerca de la investigación de Cerba
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