En un estudio reciente publicado en el bioRxiv* servidor de preimpresión, los investigadores clonaron y caracterizaron funcionalmente el sensor de ácido ribonucleico (ARN) del virus, gen-I inducible por ácido retinoico (RIG-I), del microbat Myotis daubentonii (Suborden Yangochiroptera) y el megabat Rousettus aegyptiacus (Suborden Yinpterochiroptera), y los comparó con el ortólogo humano.
Estudiar: Comparaciones funcionales del sensor de virus RIG-I de humanos, el micromurciélago Myotis daubentonii y el megamurciélago Rousettus aegyptiacus, y su respuesta a la infección por SARS-CoV-2. Haber de imagen: D. Kucharski K. Kucharska/Shutterstock
Fondo
quirópteros Los murciélagos de orden se consideran los principales reservorios de organismos virales zoonóticos emergentes. La tolerancia de los murciélagos hacia los virus altamente patógenos para los humanos ha llevado a la hipótesis de que los murciélagos podrían comprender un sistema inductor de interferón (IFN) antiviral muy activo. Sin embargo, los datos sobre la caracterización funcional de los principales constituyentes del sistema de interferón de murciélago son limitados.
El gen RIG-I puede detectar firmas de ácido ribonucleico viral que activan las vías de señalización antiviral para expresar interferón. Los autores del presente estudio informaron previamente que las células derivadas de R. aegyptiacus (Ro6E-J) y M. daubentoniid (MyDauNi) puede responder a IFN producido exógenamente.
Sobre el estudio
En el presente estudio, los investigadores ampliaron su análisis anterior al investigar si las células MyDauNi podrían producir interferón antiviral endógeno en respuesta a infecciones virales. También caracterizaron funcionalmente genes RIG-I de subórdenes Yinpterochiroptera y Yangochiroptera.
Se generaron células ΔRIG-I de riñón embrionario humano 293 (HEK293) de enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) para experimentos de cultivo celular y se trataron con ácido ribonucleico pequeño de interferencia (ARNip). Además, se utilizaron células A549, células MyDauNi y células Ro6E-J. Las células se infectaron con cepas del virus de la fiebre del Valle del Rift (RVFV) clon 13, la encefalitis cruzada (LACV), virus de la estomatitis vesicular (VSV), cultivado en células de riñón de hámster bebé (BHK), y coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2), propagado en células VeroE6.
El ARN genómico se aisló del clon 13 de VSV y RVFV y se cuantificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR). Para detectar transcritos humanos, los ensayos que utilizan IFN-β de ARN ribosomal 18S, RIG-I, ligando 10 de motivo CXC (CXCL-10), proteína 1 de resistencia a mixovirus (MxA), 2′-5′-oligoadenilato sintetasa-1 (OAS- 1) y melanoma Se utilizó la proteína 5 asociada a la diferenciación (MDA-5).
Para detectar secuencias de transcripción de longitud completa para M. daubentoniiel equipo usó un de novo Ensamblaje del transcriptoma basado en datos de secuenciación de ARN a granel (RNA-Seq) de su estudio anterior. Para R. aegyptiacus, el equipo utilizó datos de anotación y genoma disponibles públicamente para obtener secuencias de transcripción. Se realizaron experimentos de titulación de virus, clonación de ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc) y análisis bioinformáticos.
Las secuencias de ADN se tradujeron en silico, y los aminoácidos resultantes se alinearon con las secuencias genéticas. Los dominios se asignaron y confirmaron manualmente utilizando la base de datos de la herramienta de investigación de arquitectura modular simple (SMART). Se realizaron ensayos de transcomplementación de RIG-I y se evaluó la dependencia del ARN de RIG-I. Se realizaron análisis desplegables de inmunotransferencia y poliinosínico: ácido policitidílico (poli I:C).
Resultados
La organización de dominios y secuencias estaba muy conservada, con una similitud de secuencias del 93 % al 95 % entre especies diferentes. Todos los genes ortólogos de 3.0 RIG-I podrían regular la inducción de interferón en un grado comparable al ser estimulados por ácido ribonucleico viral a 37,0°C y 39,0°C. Los efectos no pudieron observarse a 30,0°C. Los resultados indicaron que los genes RIG-I de murciélagos y humanos eran funcionales a temperatura corporal normal o superior, pero no a 30,0 °C.
Similar al gen-I inducible por ácido retinoico humano, los genes ortólogos de murciélago se activaron de manera óptima utilizando ácido ribonucleico de doble cadena que termina con 5′-trifosfato y proteína de señalización antiviral mitocondrial (MAVS) necesaria para demostrar los efectos antivirales. humano y R. aegyptiacus RIG-Is podría detectar infecciones por SARS-CoV-2 a través de mecanismos inmunológicos innatos.
Los ortólogos de RIG-I de murciélago mostraron dos diferencias con respecto a RIG-I humano, una deleción de 2,0 aminoácidos en las posiciones 236 y 237 y una inserción de 5,0 aminoácidos en las posiciones 491 y 492. M. daubentonii RIG-I comprendía una eliminación de un aminoácido en la posición 195. El equipo detectó dos dominios de reclutamiento de caspasa N-terminal (CARD), un dominio helicasa, un dominio regulador C-terminal y un dominio helicasa similar a DExD como conservados entre los tres ortólogos RIG-I. RIG-I de murciélagos y humanos podría rescatar la deficiencia del gen RIG-I, independientemente de la especie de fondo.
Los ortólogos RIG-I clonados a partir de células megabat y microbat podrían ser estimulados por el ARN viral e iniciar la señalización antiviral que da como resultado la transactivación del promotor sensible al virus. Ortólogos RIG-I de humanos y R. aegyptiacus podría inducir la síntesis de ARN mensajero (ARNm) de IFN-β. Sin embargo, para humanos y R. aegyptiacus En los ortólogos de RIG-I, los niveles de inducción del ARN mensajero de citoquinas por parte del SARS-CoV-2 fueron de 5,0 a >10,0 veces más bajos que los del clon mutante 13 de RVFV. MDA5 no pareció contribuir al interferón regulado por RIG-I inducción por SARS-CoV-2.
En general, los hallazgos del estudio mostraron que RIG-I, expresado por megamurciélagos y micromurciélagos, es similar a la contraparte humana. Los genes Bat RIG-I mostraron dominios y secuencias conservadas. Mostraron acciones comparables a las del ortólogo humano en la regulación de la expresión genética activada por virus y por interferón, la dependencia de la temperatura, la señalización antiviral y el reconocimiento de ligandos de ácido ribonucleico. Además, los RIG-I de humanos y R. aegyptiacus (Yinpterochiroptera suborden) identificó infecciones por SARS-CoV-2. Los hallazgos indicaron que la capacidad de los murciélagos para albergar virus zoonóticos parecía surgir de otras características.
*Noticia importante
bioRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica/el comportamiento relacionado con la salud ni tratarse como información establecida.
