ELISA de bloqueo basado en anticuerpos monoclonales para la detección de SARS-CoV-2 en animales

*Noticia importante: bioRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica/el comportamiento relacionado con la salud ni tratarse como información establecida.

En un estudio reciente publicado en el bioRxiv* servidor de preimpresión, investigadores en los Estados Unidos describieron un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de bloqueo para identificar la exposición al síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) en animales.

La pandemia mundial de infecciones por SARS-CoV-2 plantea una grave amenaza para la salud pública. Además de los humanos, el SARS-CoV-2 puede infectar a muchas especies animales. Por lo tanto, diagnósticos altamente sensibles y específicos reactivos y se requieren ensayos para un rápido diagnóstico e implementación de medidas para la prevención y mitigación de la infección en animales.

Estudiar: Desarrollo de ELISA de bloqueo basado en anticuerpos monoclonales para detectar la exposición al SARS-CoV-2 en animales. Haber de imagen: Saiful52/Shutterstock

Sobre el estudio

En el presente estudio, los investigadores describieron la generación de un ELISA de bloqueo (bELISA) basado en anticuerpos monoclonales (mAb) para identificar la exposición al SARS-CoV-2 entre los animales.

El equipo clonó el gen sintético de la cepa SARS-CoV-2 Wuhan-hu-1 para expresar una proteína recombinante etiquetada con His y producir una N antígeno para la inmunización de ratones. Para desarrollar mAbs específicos para el SARS-CoV-2, los animales fueron inmunizados con el antígeno N creado. Después de fusionar esplenocitos de ratones con células de mieloma, los sobrenadantes producidos a partir de las células de hibridoma resultantes se evaluaron mediante un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) utilizando células MARC-145 transfectadas que expresan la proteína N. Este lisado celular se empleó para determinar si este panel de mAb podía identificar la proteína N mediante inmunoprecipitación (IP) y transferencia Western. Las células Vero infectadas con las variantes B.1 (Omicron), WA1, P.1 (Gamma), B.1.1.7 (Alpha) o B.1.617.2 (Delta) del SARS-CoV-2 se expusieron a IFA para evaluar si este panel de mAbs reconoció la proteína N presente en las células infectadas por virus.

El equipo examinó las proteínas N de cuatro CoV humanos, dos CoV felinos, dos CoV caninos y CoV de visón y hurón. En las células transfectadas se expresaron las proteínas N de cada uno de estos virus. Luego se desarrolló un bELISA basado en mAb para detectar respuestas de anticuerpos anti-N en múltiples especies animales.

SARS-CoV-2 se introdujo experimentalmente en un grupo de 24 gatos. Se recolectaron muestras de suero de gato 14 días después de la infección y se combinaron para crear un grupo de sueros de control positivo. Además, se combinaron grandes volúmenes de sueros de gatos negativos para crear un solo lote de suero de control negativo. Para investigar la sensibilidad diagnóstica y la especificidad asociadas con el bELISA basado en mAb, el equipo evaluó un panel de muestras de sangre de gatos, hurones, visones y ciervos con un estado de anticuerpos conocido. El equipo también utilizó bELISA para detectar infecciones por SARS-CoV-2 en animales domésticos. Se recogieron tres muestras de suero canino en un centro veterinario. Estos perros mostraron síntomas clínicos de enfermedades respiratorias.

Resultados

Los resultados de IFA demostraron que los cinco mAbs identificaron proteínas N que fueron expresadas por las células MARC-145. Este panel de mAbs mostró niveles variables de reactividad hacia cada variante, con los mAbs #127-3 y B61G11 exhibiendo una fuerte reactividad, #41-10 y #86-12 exhibiendo una reactividad moderada y #109-33 mostrando una reactividad leve. Según los resultados de IFA, el mAb n.º 86-12 mostró una reacción cruzada con las proteínas SARS-CoV, CCoV-tipo 1 y HCoV-OC43 N, mientras que el mAb n.º B61G11 mostró una reacción cruzada con la proteína N del SARS-CoV-2. Por el contrario, los mAb n.° 41-10, n.° 109-33 y n.° 127-3 no mostraron reacción con ninguna de las proteínas CoV N. Dado que el mAb n.° 127-3 exhibió una reactividad sustancial con muchas variantes del SARS-CoV-2 y no tuvo ninguna reacción cruzada con otros CoV comunes, incluido el SARS-CoV-1, se eligió este mAb para el desarrollo del ensayo.

Los resultados de bELISA demostraron que un valor de IP de corte del 17,60 % aumentó la sensibilidad diagnóstica al 97,8 % y la especificidad al 98,9 %. La respuesta de anticuerpos anti-N se identificó tan pronto como siete días después de la infección contra la variante Delta y B.1 antes de escalar sustancialmente a un nivel alto a los 14 días después de la infección. La respuesta de anticuerpos mediada por una variante de Omicron se observó en un punto de tiempo tardío. En comparación con las variantes B.1 y Omicron, la variante Delta produjo la mayor respuesta de anticuerpos.

Dos perros dieron positivo para anticuerpos contra el SARS-CoV-2; el tercero dio negativo para anticuerpos anti-N específicos. Los títulos de neutralización fueron 92,86 %, 37,04 % y 5,69 % para el perro 1, el perro 2 y el perro 3, respectivamente. Perro-2 demostró enfermedad crónica y realizó visitas periódicas al hospital de animales. El aumento título de anticuerpos fue encontrado por bELISA 15 días después de la investigación inicial. En el tercer examen, el título había bajado. En la cuarta evaluación, que ocurrió 176 días después de la primera, se descubrió un nivel reducido de título de anticuerpos.

Conclusión

Los hallazgos del estudio mostraron que la matriz de mAbs desarrollada en este estudio ofrece reactivos importantes para facilitar el diagnóstico de enfermedades, así como la investigación de la patogénesis viral. Los investigadores creen que bELISA basado en mAb podría ser una valiosa herramienta de campo para determinar la frecuencia de COVID-19 entre las poblaciones animales e identificar posibles nuevos reservorios animales.

*Noticia importante: bioRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica/el comportamiento relacionado con la salud ni tratarse como información establecida.