En esta entrevista, Cerba Research describe cómo sus equipos pudieron detectar la memoria residente células T en tumores sólidos gracias a la inmunofluorescencia multiplex.
¿Puede comenzar explicando cómo las células T actúan como células efectoras y por qué esto es importante?
Las células T son células efectoras inmunitarias esenciales y se les asigna el estado de objetivos preferidos para la inmunomodulación. células T se pueden clasificar como células T efectoras (Teff) o T reguladoras (Treg).
Las células de teff facilitan respuestas inmunitarias óptimas contra microbios invasores y antígenos tumorales. En condiciones homeostáticas, las Treg fomentan la tolerancia periférica.
Sin embargo, las Treg pueden causar la supresión de las funciones de las células Teff dentro de los tumores. Las complejas interacciones entre Teff y Treg determinan el resultado de las respuestas inmunitarias específicas del tumor. La supervivencia favorable en varios tipos de cáncer se ha asociado con proporciones altas de células Teff a Treg según lo establecido por varios métodos como la citometría de flujo o la inmunohistoquímica en secciones en serie.
La inmunofluorescencia multiplex ofrece una ventaja técnica al permitir la detección de la coexpresión y la organización espacial de múltiples objetivos dentro de una arquitectura de tejido conservada en un solo portaobjetos.
¿Cuál fue el objetivo principal de su estudio?
El principal objetivo era demostrar la utilidad de Histalim PERFIL HISTÓRICO® -Treg panel de inmunofluorescencia multiplex humano y de ratón para identificar células Treg y Teff en el lugar.
¿Qué métodos se utilizaron?
A lo largo del estudio, se aplicaron varios métodos, incluido el diseño de panel y la validación de objetivos y el protocolo multiplex secuencial con Opal® (Akoya Biosciences) fluoróforos en el BOND RX® (Leica) teñidor de portaobjetos.
Imágenes multiespectrales del modelo de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) murino subcutáneo, micromatrices de tejido humano y tumores de carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) se adquirieron con el VECTRA® Escáner de portaobjetos PolarisTM (Akoya Biosciences).
¿Podría explicar cómo se realiza la validación del panel?
La validación del panel se realiza mediante una comparación de tinción simplex y multiplex. Los portaobjetos simplex se tiñeron para los biomarcadores individuales en un protocolo simplex y se compararon con una sección en serie teñida con el IHC multiplex.
La concordancia de tinción entre el portaobjetos multiplex y los portaobjetos simplex se determinó ejecutando el análisis con HALO® después de la deconvolución multiespectral. El porcentaje de células positivas del portaobjetos simplex se comparó con el portaobjetos multiplex y se obtuvieron resultados satisfactorios tanto para HISTOPROFILE® -Paneles Treg.
¿Cuáles fueron los resultados arrojados durante el estudio?
Después de aplicar el Histoprofile®-Panel humano Treg a tres tejidos de carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) usando Leica Bond RX, las imágenes multiespectrales fueron capturadas usando Vectra Polaris.
Desconvolucionamos las imágenes adquiridas con INFORMAR softwarepermitiéndonos detectar células CD3/CD8 doble positivas y Tregs (CD3+, CD4+, CD25+, FoxP3+) usando el módulo HALO.
La variabilidad de Teff/Treg se puede apreciar fácilmente entre las muestras.
¿Cómo informó el estudio sus hallazgos y cuál fue una de sus conclusiones durante el estudio?
Durante el estudio, el enfoque demuestra el poder efectivo del Histoprofile de Histalim® Inmunohistoquímica Treg multiplex y cómo sirve mejor para identificar y cuantificar numerosas poblaciones de células inmunitarias en un solo tejido. Esto revela un importante potencial de aplicación para este método en una amplia gama de tejidos en entornos clínicos y preclínicos.
Los portaobjetos simplex se tiñeron para cada biomarcador individual en un protocolo simplex y se compararon con una sección en serie teñida con HISTOPROFILE® Panel multiplex TRM La concordancia de tinción entre el portaobjetos multiplex y los portaobjetos simplex se determinó mediante análisis con HALO® sin deconvolución multiespectral A) Imagen de ejemplo de una amígdala humana sana teñida multiplex La coexpresión de los cinco marcadores en el panel CD103 CD69 CD8 CD3 CD49 a se puede apreciar en el zoom B) Imágenes de ejemplo correspondientes al portaobjetos multiplex para CD8 (y el diapositiva simplex (y el HALO correspondiente® máscaras que identifican las células positivas C) El porcentaje de células positivas de los portaobjetos del panel simplex (barras azules) y multiplex (barras moradas) que muestran perfiles de tinción comparables entre los portaobjetos. La precisión del protocolo se determinó mediante análisis de repetibilidad intraejecución y análisis de reproducibilidad interejecución (datos no mostrados). Crédito de la imagen: Investigación de Cerba
Crédito de la imagen: Investigación de Cerba
Tres muestras de NSCLC se tiñeron con el HISTOPROFILE® Panel TRM e imagen con el VECTRA® PolarisTM Las imágenes multiespectrales de barrido completo se analizaron con HALO® A) Ejemplo del panel múltiplex en cada una de las tres muestras de NSCLC: CD8 (naranja) CD103 (verde) CD49a (blanco) CD69 (amarillo) CD3 (rojo). Barra de escala de 40 µm En la bibliografía, se han fenotipado TRM mediante diferentes combinaciones de los marcadores utilizados en el panel Los marcadores se combinaron para analizar diferentes subtipos de TRM CD8+/CD103, CD8+/CD49a, CD8+/CD69, CD8+/CD103+/CD69, CD8+/CD103+/CD69+/CD49a en áreas tumorales y no tumorales de las tres muestras humanas de NSCLC B) Imágenes de ejemplo del HISTOPROFILE® panel TRM y las poblaciones individuales con la imagen fluorescente y las máscaras celulares correspondientes para los diferentes subtipos de células TRM Barra de escala 100 µm C) La frecuencia de las células T residentes en memoria (CD8+ CD103+) en la región tumoral (barras azules) y en el área no tumoral (barras moradas) D) Se analizó la distribución normalizada de diferentes subpoblaciones de células T residentes en las regiones tumorales y no tumorales de las tres muestras de NSCLC CD8+/CD103+ (azul) CD8+/CD49a+(púrpura) CD8+/CD69+(verde pálido), CD8+/CD103+/CD69+(rosa) CD8+/CD103+/CD69+/CD49a+(azul oscuro). Crédito de la imagen: Investigación de Cerba
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